一、前期準(zhǔn)備
放置配件與器具：按使用要求放置好必要的配件和器具，如無毒塑料袋、鈀粒（密封）、干燥劑、厭氧指示劑（或美蘭指示條）、乳膠手套等。
連接氣路：將混合氣瓶、氮氣瓶安放平穩(wěn)，并分別安裝好減壓閥（含壓力表），調(diào)節(jié)減壓閥使輸出壓力為0.05~0.1Mpa。然后接上氣路并檢查，必要
二、形成厭氧環(huán)境
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第一次氮氣置換：
- 把乳膠手套套在觀察板法蘭圈上并扎緊。
- 接通氮氣進(jìn)氣路，打開氮氣控制閥，使兩只塑料袋充足氮氣后，關(guān)閉電磁閥，然后扎緊袋口。
- 把塑料袋內(nèi)氮氣漸漸地放于操作室內(nèi)，至全部放出。
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第二次氮氣置換：重復(fù)一次充氮過程，取樣室先抽真空，并注意隨時開閉排氣閥。
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第三次氮氣置換：再次重復(fù)充氮過程，確保操作室內(nèi)氮氣濃度。
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混合氣體置換（混合氣體配比根據(jù)實際需求，如N2 85%、H2 10%、CO2 5%或H2 1/85%、H2 1/10%、CO2/15%等）：
- 調(diào)換氣路打開操作室混合氣閥進(jìn)氣，充氣時取樣室先抽真空，并注意隨時開閉排氣閥。
- 混合氣充滿塑料袋后，關(guān)閉電磁閥，并打開混合氣限流閥，使混合氣經(jīng)過穩(wěn)流器、流量計，調(diào)整流量計使流量為每分鐘10毫升左右。
- 把塑料袋內(nèi)混合氣漸漸排于操作室內(nèi)。通過三次換氣后，操作室內(nèi)氣體含氧量已處于極微量狀態(tài)。
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催化除氧：操作室內(nèi)打開鈀粒除氧劑，接通除氧催化器電源進(jìn)行催化除氧。1~2小時后（具體時間根據(jù)設(shè)備性能而定），打開厭氧指示條觀察其變色情況，如指示條變色（由深藍(lán)變?yōu)闇\藍(lán)）則為操作室內(nèi)達(dá)到厭氧環(huán)境。
三、滅菌處理
開啟紫外線滅菌燈，對操作室內(nèi)進(jìn)行滅菌處理。滅菌時間根據(jù)實驗需求自定。
四、菌種置入與培養(yǎng)
- 檢查并關(guān)緊取樣室內(nèi)門。
- 打開取樣室外門：將菌種放入取樣室后即關(guān)上外門。
- 取樣室充氮置換：打開真空泵，先抽真空度（如500毫米汞柱以上），然后人工打開氮氣閥進(jìn)氣，使指針回復(fù)零位后關(guān)掉氮氣閥。重復(fù)此過程三次，以確保取樣室內(nèi)氮氣濃度。第三次操作時，可打開混合氣體閥進(jìn)混合氣，使指針回復(fù)零位后關(guān)掉混合氣體閥。
- 檢驗真空度：如選定真空度較低則需要增加置換的次數(shù)。取樣室外門開啟、關(guān)緊后，再抽低真空度（如100毫米汞柱）進(jìn)行檢驗。
五、長期連續(xù)使用條件
- 定期觀察：每天在操作室內(nèi)打開厭氧指示條觀察，如指示條變色不正常則需重新?lián)Q氣。
- 連續(xù)輸入混合氣體：要長期連續(xù)輸入微量的混合氣體，使補(bǔ)進(jìn)的氮氣能和微量的氧結(jié)合通過催化吸收，保證室內(nèi)厭氧狀態(tài)。補(bǔ)入混合氣流量可選定為每分鐘10毫升左右。
- 更換除氧劑和干燥劑：連續(xù)培養(yǎng)運行時，每天更換一次除氧劑和干燥劑。換下的除氧劑和干燥劑可放在200℃干燥箱內(nèi)干燥2~3小時以復(fù)原。
六、注意事項
- 設(shè)備安裝：整機(jī)應(yīng)安放在溫度溫差較小、操作方便的位置，避免陽光直曬和遠(yuǎn)離采暖設(shè)備，放置要平穩(wěn)。
- 儀表安裝：儀表應(yīng)盡可能地安裝于空氣清靜、溫度變化較小的地方。
- 熟悉設(shè)備：開機(jī)前應(yīng)全面熟悉和了解各組成配套儀器、儀表的說明書，掌握正確的使用方法。
- 故障處理：如發(fā)生故障（如停氣等），操作室內(nèi)仍可保持一段時間（如10~12小時）的厭氧狀態(tài)。超過此時間則根據(jù)需要把培養(yǎng)物取出另作處理。
- 氣瓶更換：調(diào)換氣瓶時，注意要扎緊氣管，避免流入含氧氣體。
- 真空泵維護(hù)：真空泵應(yīng)按要求使用，并定期檢查加油。
通過以上步驟，可以正確、有效地使用厭氧培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧菌的培養(yǎng)。
